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Unión de proteínas

Una vez que un fármaco ingresa a y aparece en la circulación sistémica, solamente la fracción libre no unida es capaz de tener un efecto farmacológico (o toxicológico). El alcance de la unión de proteínas de plasma se puede determinar in vitro o ex vivo mediante diálisis de equilibrio, ultrafiltración o ultracentrifugación.

  • El cumplimiento de las reglamentaciones

  • Métodos diversos

  • Análisis para determinar eficacia y seguridad

La partición de un artículo de prueba en eritrocitos vs. plasma se puede determinar in vivo o ex vivo en sangre animal y humana. La unión de proteínas microsomales se puede evaluar mediante diálisis de equilibrio. Los datos que describen cómo el fármaco se une a proteínas de plasma y cómo funciona la partición de sangre a plasma son necesarios para evaluar datos farmacológicos, farmacocinéticos y toxicológicos. (Vea también SEND 3,1)

Consideraciones reglamentarias para estudios de unión de proteínas de plasma, partición de sangre a plasma y unión de proteínas microsomales

La investigación de la fracción no unida del plasma o proteína microsomal de un artículo de prueba es fundamental para caracterizar el perfil farmacocinético in vivo de los márgenes de dosis, exposición, eficacia y seguridad en farmacología clínica. La evaluación entre especies de la unión de proteínas de plasma es un requisito de IND y se detalla en la directiva M3(R2) para ICH.

Métodos

  • Sistema de prueba: plasma agrupado de cada especie o soluciones de proteína de plasma específicas (por ej., albúmina en suero humana, glicoproteína de ácido α1, gammaglobulina)
  • Se seleccionan las concentraciones para abarcar exposiciones clínicas conocidas (0,1 - 10X Cmax), a menos que haya una limitación por la solubilidad.
  • Diálisis de equilibrio
  • El diálisis de equilibrio se realiza usando un aparato de diálisis de alto volumen (HTDialysis LLC, Gales Ferry, CT). Se agrega una matriz fortificada (ya sea plasma o proteína de plasma aislada) a la cámara del donante y se agrega solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) a la cámara del receptor de cada pocillo. Las placas luego se sellan con una membrama permeable de gases y se incuba a 37 °C en 5% CO2 por el tiempo designado (ver abajo). Después de la incubación se analizan las muestras de cada cámara usando cromatografía de líquidos-espectometría de masas (LC-MS).
  • Estabilidad en la matriz: el artículo de prueba se incuba en plasma y en DPBS a una sola concentración de hasta cinco puntos temporales.
  • Tiempo al equilibrio: el artículo de prueba se agrega al plasma a una sola concentración y se dializa contra el DPBS para hasta cinco puntos temporales.
  • Dependencia de concentración de unión de proteínas: el artículo de prueba se agrega al plasma a tres concentraciones y se dializa contra el DPBS por el tiempo requerido para el equilibrio.
  • Un control positivo como warfarin se prueba en diálisis de equilibrio paralela por ≥5 horas.
  • Ultrafiltración 
  • El plasma fortificado se agregará a la porción de la reserva de plasma de un dispositivo de ultrafiltración con un corte de peso molecular de 30.000 Da. Las muestras se centrifugarán a 37 °C y 2.000 × g por 15 minutos (u otras condiciones apropiadas). Después de la centrifugación, el ultrafiltrado se analizará por LC-MS para detectar el artículo de prueba y comparar el contenido con las concentraciones iniciales. Todas las determinaciones de unión de proteínas se harán por triplicado.
  • Unión no específica: el artículo de prueba se agrega al ultrafiltrado de plasma (PUF) de control a dos concentraciones y se centrifuga según el procedimiento de ultrafiltración. Se analizará el dialisato para determinar la recuperación del artículo de prueba y la posible unión no específica en la ausencia de plasma.
  • Dependencia de concentración de unión de proteínas: el artículo de prueba se agrega al plasma a cinco concentraciones y se centrifuga según el procedimiento de ultrafiltración. El ultrafiltrado se analizará para detectar el artículo de prueba.
  • Ultracentrifugación
  • El plasma fortificado se agregará a los tubos de la ultracentrifugadora y se centrifugarán a 37 ºC a 223.000 × g por 4 horas (u otras condiciones apropiadas) para alcanzar la separación del ultracentrifugado de plasma de la proteína de plasma. Tras la centrifugación, el ultracentrifugado se analizará por LC-MS y se comparará con las concentraciones iniciales.
  • Unión no específica: el artículo de prueba se agrega al plasma de control y ultrafiltrado de plasma (PUF) a dos concentraciones y se incuba en los tubos de la ultracentrifugadora por 4 horas. Se analizará la matriz para determinar la recuperación del artículo de prueba y la posible unión no específica en la ausencia de plasma.
  • Dependencia de concentración de unión de proteínas: el artículo de prueba se agrega al plasma a cinco concentraciones y se centrifuga según el procedimiento de ultracentrifugación. El ultracentrifugado se analizará para detectar el artículo de prueba.

  • Los estudios partición de sangre a plasma (BPP) se usan para determinar la partición de sangre a plasma de un artículo de prueba en sangre de diversas especies, incluso humana.
  • Sistema de prueba: la sangre obtenida de cada especie animal se puede agrupar de al menos tres donantes. La sangre humana obtenida de al menos tres voluntarios no se agrupará.
  • Se determinan los valores de hematocritos para las muestras de sangre animal agrupada y las muestras de sangre humana individuales.
  • La sangre se almacena a 2-8 °C y se usa lo antes posible dentro de 1 semana de su recepción.
  • Se agrega el artículo de prueba a la sangre y se toman las alícuotas iniciales. La sangre fortificada se incuba a 37 °C según lo indicado. Tras la incubación, las alícuotas se extraen para su análisis. La sangre restante se centrifuga para obtener plasma; se recogen las alícuotas para su análisis y se comparan con las alícuotas iniciales.
  • Estabilidad en matriz: el artículo de prueba se incuba en sangre a una sola concentración por hasta cuatro puntos temporales.
  • Tiempo al equilibrio: el artículo de prueba se agrega a la sangre a  una sola concentración por hasta cuatro puntos temporales.
  • Dependencia de concentración de unión de proteínas: el artículo de prueba se agrega a la sangre a hasta 5 concentraciones y se incuba hasta punto temporal de equilibrio.
  • Para artículos de prueba radioetiquetados, las alícuotas de sangre se solubilizan antes del recuento por centelleo líquido (LSC). Para artículos de prueba no radioetiquetados, las alícuotas de sangre se lisan antes de la extracción y análisis usando  cromatografía de líquidos-espectometría de masas (LC-MS).

  • Una evaluación de la posibilidad de que un artículo de prueba una proteínas microsomales hepáticas humanas in vitro permite la corrección de fracción no unida en ensayos que usan estos sistemas.
  • El diálisis de equilibrio se realiza en triplicados usando un aparato de diálisis de alto volumen (HTDialysis LLC, Gales Ferry, CT). Se agregan microsomas fortificados a la cámara del donante y se agrega un buffer de ensayo a la cámara del receptor de cada pocillo. Las placas luego se sellan con una membrama permeable de gases y se incuba a 37 °C en 5% CO2 por 5 horas. Después de la incubación se analizan las muestras de cada cámara usando cromatografía de líquidos-espectometría de masas (LC-MS).
  • Unión de proteínas: los microsomas hepáticos humanos se diluyen a tres concentraciones (0.05, 0.1, 0,5 mg/mL) en buffer de fosfatos. Luego se agrega el artículo de prueba a los microsomas a tres concentraciones para un total de 9 muestras. Las muestras de matriz fortificada se transfieren a las cámaras del donante HTD en triplicados y se dializan contra fosfato por 5 horas.
  • Estabilidad en microsomas: las muestras de matriz fortificada de arriba se incuban a 37 °C en 5% CO2 por 0 y 5 horas.

 

Productos finales

Los ensayos de unión de proteínas de plasma identificarán el alcance de la unión del artículo de prueba, con un porcentaje de unidas y no unidas, el tiempo en que se alcanza el equilibrio en diálisis y el perfil de dependencia de concentración en humanos y otras especies preclínicas seleccionadas. La partición de sangre a plasma generará un coeficiente de partición. Estos datos luego se pueden usar para calcular la fracción libre en plasma y así corregir las exposiciones in vivo conforme a los márgenes de eficacia y seguridad del perfil.

Los ensayos de unión de proteínas microsomales identificarán el alcance de unión de proteínas microsomales hepáticas humanas con el artículo de prueba para corregir parámetros como IC50 u otros y así abarcar la fracción sin el fármaco.