La reacción en cadena de la polimerasa digital, o ddPCR, se basa en particionar muestras de ácido nucleico en decenas de miles de microgotas de un volumen determinado en una emulsión de agua y aceite. La amplificación de las secuencias de ácido nucleico objetivo se realiza dentro de cada microgota con un flujo de trabajo y reactivos similares a los que se usan en el ensayo de probeta TaqMan®. Con base en la detección por fluorescencia después de la amplificación, se cuenta cada gota y se califica como positiva o negativa en la PCR. La concentración de ADN/ARN objetivo (copias/µl) de la muestra original se cuantifica con el sistema de distribución de Poisson.1,2
La ddPCR permite medir cantidades absolutas de secuencias de ácido nucleico por volumen de muestras sin extrapolar las curvas estándar o los puntos de referencia. Puede detectar cambios pequeños de pocas repeticiones en volúmenes de muestras muy bajos, que podrían no detectarse con la qPCR. Los resultados de la ddPCR son más precisos, sensibles y exactos que con la qPCR debido a los miles de puntos de datos que se obtienen por cada muestra.
La ddPCR puede detectar cualquier tipo de secuencia de ADN o ARN para las que se pueden construir iniciadores y sondas, como ctDNA, cfDNA/RNA, mRNA, rRNA, snRNA, snoRNA, miRNA o siRNA.
Se puede usar cualquier muestra que contenga secuencias de ADN o ARN para una ddPCR, como lisis celular y tisular, tejido, fluidos biológicos (sangre, líquido cerebroespinal, lágrimas, orina, salvia, etc.), sobrenadantes o productos sintéticos de ácido nucleico.
Como con una qPCR, el proceso en general lleva unas cuatro horas. El flujo de trabajo de la ddPCR requiere un paso extra para crear las decenas de miles de microgotas de nanolitros de aceite. Sin embargo, el tiempo extra para este paso se compensa con la simplificación del análisis digital del lector de la ddPCR.
Las muestras que consisten en ADN/ARN extraído/aislado/purificado se pueden procesar y analizar con el sistema de ddPCR Bio-Rad QX200 inmediatamente. Las muestras de sobrenadantes celulares y lisis celular/tisular requieren la extracción/aislación/purificación del ADN o ARN para poder realizar la prueba de ddPCR. Para garantizar la seguridad del personal del laboratorio de Labcorp, los tejidos, fluidos biológicos y sobrenadantes celulares se deben someter a pruebas de patógenos obligatorias antes de su manipulación en los laboratorios de Labcorp. Además, para todos los materiales de origen humano (tejido o fluidos corporales), microorganismos o virus, productos creados en sistemas biológicos con potencial de generar contaminación de bioseguridad y las moléculas recombinantes y/o sintéticas de ácido nucleico se debe completar un Formulario de Registro de Bioseguridad y se debe obtener la correspondiente aprobación del comité de Bioseguridad de Labcorp antes de manipular los materiales.
Si no desea extraer/aislar/purificar el ADN/ARN antes de enviar las muestras para la ddPCR, Labcorp PCO recomienda proteger/estabilizar/preservar los ácidos nucleicos en muestras de célula o tejido, con una solución conservante de ácido nucleico (como RNAlater®, DNA/RNA ShieldTM, or RNAprotect®) antes de congelarlas y enviarlas.
Todas las muestras se deben enviar congeladas en una caja con aislante y hielo seco.
1. Sistema QX200 Droplet Digital PCR. BIO-RAD. https://www.bio-rad.com/en-us/life-science/digital-pcr/qx200-droplet-digital-pcr-system.
2. Taylor SC, Laperriere G, Germain H. Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Sci Rep. 2017;7:2409. doi:10,1/s41598-017-02217-x.
