Inhibición de enzimas

Método

• Sistema de prueba: microsomas de hígado humano (HLM) agrupados
• Enzimas CYP evaluadas: CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6,CYP2E1 y CYP3A4/5
• Enzimas UGT evaluadas en ensayos de inhibición directa a pedido: UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT11A6, UGT1A9, UGT2B7, UGT2B15
• Concentraciones de artículos de prueba: 8 concentraciones por triplicado
• Todas las preparaciones e incubaciones de muestras se llevan a cabo mediante un sistema automatizado de manipulación de líquidos Hamilton Microlab Star

La inhibición de CYP se mide en ensayos directos y dependientes. Se usa un sustrato selectivo de CYP a una concentración que alcanza la mitad de la velocidad de reacción máxima (K_m) para cada enzima CYP (ver a continuación). Se usan inhibidores conocidos como controles positivos para ensayos de inhibición directa y dependiente del metabolismo. Todas las incubaciones concluyen con la incorporación de acetonitrilo refrigerado, que contiene un estándar de metabolitos internos con marcado estable específico para el sustrato de CYP.

Inhibición dependiente del tiempo (irreversible)

Se incuban los ensayos con 8 concentraciones del artículo de prueba en ausencia y presencia de NADPH por 30 minutos antes de la dilución en un compuesto de sustrato de prueba. Si se observa una inhibición dependiente del tiempo notable, es posible determinar parámetros cinéticos adicionales, que incluyen la constante de inactivación (k_inact) y la constante de inhibición (K_I). Estos parámetros, que se determinan de forma experimental a través de la variación del tiempo previo a la incubación y la concentración de inhibidores, pueden ayudar a definir el potencial de interacciones entre fármacos.

Inhibición directa

Los ensayos se llevan a cabo en ausencia y presencia de 8 concentraciones del artículo de prueba para determinar el potencial de inhibición y definir una IC50 donde sea posible.

Es posible profundizar la caracterización de la inhibición directa al determinar la constante de inhibición (K_i) y el tipo de inhibición observado, mediante el uso de 5 concentraciones del sustrato de prueba.

Productos finales

Estos ensayos proporcionarán los valores de IC₅₀ para la inhibición directa o irreversible de enzimas CYP. Si se observa una inhibición directa significativa, se puede determinar la constante de inhibición (K_i). Si se observa una inhibición dependiente del tiempo significativa, se pueden determinar los parámetros de inactivación basados en los mecanismos (K_I y k_inact). Con estos parámetros, la farmacometría puede ofrecer orientación adicional a la hora de evaluar la necesidad de un ensayo clínico.