Métodos
- Sistema de prueba: microsomas hepáticos humanos agrupados y enzimas humanas recombinantes expresadas individualmente con los cofactores necesarios
- Isoformas CYP: CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 y CYP3A4. (También hay otras enzimas CYP, UGT y enzimas metabolizadoras de fármacos disponibles).
- Inhibidores químicos específicos de isoformas y enzimas recombinantes para confirmación.
El artículo de prueba se preincuba por al menos 5 minutos con microsomas en buffer de fosfatos. El metabolismo del artículo de prueba se inicia con la adición de NADPH u otro cofactor adecuado. Las incubaciones se terminan con la adición de un solvente orgánico y luego se analizan las muestras para detectar el artículo de prueba y/o sus metabolitos usando cromatografía de líquidos-espectometría de masas (LC-MS).
Fase I: optimización de condiciones de incubación in vitro
El artículo de prueba se incuba en triplicados con una variedad de concentraciones de microsomas (generalmente 0,1 - 1 mg deproteína/mL) por cuatro puntos temporales de hasta 60 minutos en presencia de NADPH u otro cofactor adecuado.
Se realizan incubaciones de control en ausencia de un cofactor. Las condiciones de incubación de concentración de microsomas y punto temporal que producen una índice lineal de desaparición del artículo de prueba se usan para definir los experimentos de seguimiento.
Fase II: análisis cinético del metabolismo del artículo de prueba
Los índices de qué tan rápido desaparece el artículo de prueba se monitorean en las muestras de incubación con al menos ocho concentraciones del artículo de prueba en triplicados bajo condiciones optimizadas. Los datos se analizan usando la curva de Michaelis-Menten y se determinan los parámetros cinéticos Km y Vmax para el artículo de prueba.
Fase III: análisis de inhibición usando inhibidores químicos específicos de CYP
El artículo de prueba se incuba en triplicados a una concentración de <Km con microsomas hepáticos humanos agrupados en la ausencia o presencia de inhibidores químicos selectivos de enzimas. Se realizan incubaciones de control en la ausencia del inhibidor usando solo solvente.
Fase IV: metabolismo usando CYP humanas recombinantes
El artículo de prueba se incuba en triplicados a una concentración de <Km con una variedad de CYP y UGT humanas recombinantes, y otras DME (ver arriba). Se mide la concentración relativa del artículo de prueba a los 0 y 60 minutos.
Productos finales
Estos ensayos identificarán las enzimas responsables de y el alcance de metabolismo del artículo de prueba in vitro. Se determina la cinética de la desaparición del artículo de prueba y/o formación de metabolitos. La evaluación de metabolismo in vitro identifica a las enzimas principales involucradas y detecta posibles problemas en el mecanismo de eliminación in vivo antes de hacer pruebas en humanos.